Příprava pufrů k fixaci a demineralizaci tkání

Overview

Na oddělení laboratorních diagnostik nemocniční lékárny FN Motol připravujeme celou řadu zkoumadel, roztoků nebo pufrů pro laboratorní provozy naší nemocnice.

Pro patologii vyrábíme pufry na fixaci a demineralizaci tkání. Z takto zpracovaných tkání je následně možné připravovat preparáty pro použití při dalších vyšetřovacích metodách.

Abychom zabránili samovolné autolýze tkáně, je nutné ji fixovat. Fixace musí probíhat dostatečně dlouhou dobu a s dostatečným nadbytkem fixativ (optimálně 20–50x více než je objem tkáně, obvykle však postačuje desetinásobný objem fixačního média). Během fixace dochází k inaktivaci enzymů. Fixace musí probíhat šetrně a je důležité, aby fixativa pronikala do tkání dostatečně rychle, aby byla zachována struktura a následná barvitelnost tkání.

V zásadě je možná fixace 10% formolem (jedná se o 4% roztok formaldehydu) –⁠ tkáň fixovaná formolem a zalitá do parafinových bloků je vhodná pro histologická barvení, imunohistochemická vyšetření, hybridizační techniky; dochází při ní k vzájemnému zesíťování polymerů (na stejném principu funguje i glutaraldehyd).

Formaldehydový pufr pH 7,2 na uchovávání a fixaci tkání připravujeme dle následující receptury a pH upravujeme na požadovanou hodnotu 7,2 pomocí hydrogenuhličitanu sodného nebo kyseliny fosforečné až po třech dnech stání připraveného roztoku v chladu a temnu.

Roztok formaldehydu (36–38 %)       100,0 ml

NaH₂PO₄.2H₂O                                            4,00 g

Na₂HPO₄.12H₂O                                         6,50 g

NaHCO₃                                                       8,00 g                     

Aqua purificata  ad 1 000,0 ml

Z dalších fixačních metod je možné použít fixaci mrazením (nejčastěji bývá používaná pro peroperační vyšetření, enzymovou histochemii nebo izolace NK pro molekulární metody), fixaci chloridem rtuťnatým nebo kyselinou pikrovou (založeno na principu koagulace proteinů) a v neposlední řadě také fixaci ethanolem, metanolem či acetonem, kdy dochází k fixaci na základě dehydratace tkání.

K fixaci srdce plodů na pitevnách se používá neutrální formol podle následující receptury:

Roztok formaldehydu (36–38 %)          200 ml

NaH₂PO₄                                                        4,0 g

Na₂HPO₄ bezvodý                                         6,5 g

Aqua purificata                                        800 ml

Při zpracování tvrdých tkání, jako jsou kosti nebo zuby, je nutné provést po vlastní fixaci ještě demineralizaci. Demineralizace je nutná, aby tkáň změkla a bylo ji možné dále zpracovávat, například krájet na mikrotomu po zalití do parafínu.

Demineralizaci je možné provést rozpouštěním v kyselině dusičné, kyselině trichloroctové nebo kyselině mravenčí. Tento typ demineralizace (někdy bývá ne úplně přesně použit termín odvápnění neboli dekalcifikace) probíhá rychle, trvá řádově hodiny, ale kyselostí je snížena barvitelnost jader buněk a často je zhoršena proveditelnost imunohistochemických vyšetření.

Pro demineralizaci tkání je proto vhodnější používat chelatační činidla. Naše lékárna připravuje k demineralizaci zkoumadlo edetanu disodného pH 7,0–7,3 dle níže uvedené receptury (pH upravujeme pomocí hydroxidu sodného):  

Edetan disodný                                        187,2 g

Aqua purificata  ad 1 000,0 ml

Při použití chelatačního činidla trvá samotná demineralizace sice déle, ale díky šetrné demineralizaci tkání zůstává barvitelnost tkání zachována.

Veronika Horáková